癌癥的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前學(xué)界廣泛接受的觀點(diǎn)是相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因。即在各種因素的影響下：

• 原癌基因產(chǎn)生突變，導(dǎo)致細(xì)胞無限制生長；

• 抑癌基因失活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖與休眠紊亂，不能正常凋亡。

最終質(zhì)變?yōu)榧?xì)胞及組織水平的變異，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。

所以癌癥的發(fā)生和發(fā)展實(shí)際上是一個(gè)較為漫長的過程，在臨床中，完全可以通過基因檢測(cè)，達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的目的。

目前，癌癥相關(guān)基因檢測(cè)主要基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和高通量測(cè)序（NGS）兩項(xiàng)技術(shù)，其中qPCR具有多項(xiàng)技術(shù)優(yōu)勢(shì)：準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單、成本較低，被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室及臨床診斷中。

今天，我們就來好好聊一聊qPCR

探針法qPCR 技術(shù)原理：

qPCR依據(jù)檢測(cè)原理不同，分為染料法和探針法。探針法qPCR需針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)特異性引物與特異性熒光探針，探針的5’端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)（Reporter，如FAM、VIC、HEX等），3’端標(biāo)記一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)（Quencher，如TAMRA、BHQ1等）。

• 當(dāng)熒光探針保持結(jié)構(gòu)完整時(shí)，探針與模板退火結(jié)合，其特異性結(jié)合位點(diǎn)位于正反兩條引物之間。5’端報(bào)告基團(tuán)受儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3’端淬滅基團(tuán)淬滅，儀器檢測(cè)不到5′端報(bào)告基團(tuán)所激發(fā)的熒光信號(hào)。

• 隨著擴(kuò)增進(jìn)行，DNA聚合酶在延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，因其雙鏈特異性的5’-3’外切酶活性，就會(huì)切割熒光探針，釋放5’端報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中，遠(yuǎn)離3’端淬滅基團(tuán)，此時(shí)5’端報(bào)告基團(tuán)受激發(fā)所產(chǎn)生的熒光信號(hào)就可以被儀器檢測(cè)到。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)游離的熒光分子形成，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，最終通過數(shù)據(jù)分析實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的定量。

圖1. 探針法qPCR技術(shù)原理示意圖

作為一種有效的癌癥篩查檢測(cè)及伴隨診斷技術(shù)，探針法qPCR涉及領(lǐng)域涵蓋癌癥的預(yù)防與治療。這項(xiàng)技術(shù)不但能有效地檢測(cè)到基因的突變，還可以準(zhǔn)確檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)量。

qPCR應(yīng)用于癌癥篩查

探針法qPCR目前已廣泛應(yīng)用于多種癌癥相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)，包括：

• 端粒酶hTERT基因

• 慢性粒細(xì)胞性白血病WT1基因

• 腫瘤ER基因

• 前列腺癌PSM基因

• 宮頸癌相關(guān)病毒HPV

• ……

其中女性高發(fā)惡性腫瘤之一的宮頸癌，早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療，可以達(dá)到非常好的療效，治愈率在90%左右。目前已證實(shí)高危人乳頭瘤（HPV）病毒持續(xù)感染與宮頸癌有著密切聯(lián)系，因此，對(duì)于高危HPV病毒的專項(xiàng)檢測(cè)，已成為宮頸癌篩查的重要手段。高危HPV病毒核酸檢測(cè)與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合篩查被越來越多的應(yīng)用于臨床。

圖2. 高危HPV病毒核酸檢測(cè)與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合篩查可有效降低漏診率

qPCR應(yīng)用于抗癌藥物研發(fā)

除此之外，探針法qPCR還可應(yīng)用于抗癌藥物的研發(fā)。在新藥的開發(fā)過程中，快速了解藥物對(duì)癌癥進(jìn)程的影響可以為新藥開發(fā)節(jié)約大量的人力、時(shí)間和資金。

與Elisa等方法相比，探針法qPCR技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確、靈敏地測(cè)定血液或組織中目的基因的表達(dá)量，為比較不同配方的療效、用藥量、用藥時(shí)間等，提供快速、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。

圖3. qPCR檢測(cè)流程示意圖

手把手實(shí)驗(yàn)教學(xué)

p53是重要的抑癌基因，幾乎參與所有癌癥的發(fā)生與發(fā)展，其編碼蛋白有促使損傷DNA修復(fù)、損傷細(xì)胞凋亡從而防止癌變的功能。

假設(shè)現(xiàn)在有兩種配方藥物，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，看不同配方藥物對(duì)p53 mRNA水平的影響，應(yīng)該怎樣來設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以及分析結(jié)果呢？

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):

分別種三皿細(xì)胞，一皿加入配方一藥物，另外一皿加入配方二藥物，剩下一皿加入對(duì)照。處理一段時(shí)間之后，分別收集細(xì)胞并提取RNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行qPCR。qPCR如下圖所示進(jìn)行加樣：

圖4. qPCR加樣示意圖

注意區(qū)分 “技術(shù)重復(fù)”和“生物學(xué)重復(fù)”這兩個(gè)概念，圖4中p53和β-actin每個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都各有三個(gè)qPCR復(fù)孔，這是技術(shù)重復(fù)，目的是消除本次實(shí)驗(yàn)的操作誤差。生物學(xué)重復(fù)指的是做三次獨(dú)立的重復(fù)試驗(yàn)，目的是消除組內(nèi)誤差、提高結(jié)果的可靠性。在本例中，就要求在其他時(shí)間另外再種三皿細(xì)胞，再分別處理后提取RNA，接著再做反轉(zhuǎn)錄和qPCR，如此做了三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)之后才能算作三次生物學(xué)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)誤差的來源應(yīng)該包括生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)。

做完上述實(shí)驗(yàn)之后，假設(shè)得到結(jié)果如下：

表1. Test1 Ct值結(jié)果

再做兩次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，假設(shè)得到結(jié)果如下：

表2. Test2 Ct值結(jié)果

表3. Test3 Ct值結(jié)果

結(jié)果分析:

下表為完整計(jì)算過程（ΔCt=Ct p53-Ct β-actin；ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組）：

表4. 相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法示例

整理一下數(shù)據(jù)（相對(duì)表達(dá)量平均值=2-ΔΔCt平均值）：

表5. p53相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)

就可以生成p53 mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量柱形圖了：

圖5. p53 mRNA水平相對(duì)表達(dá)量柱形圖

到這里，離獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)論只有一步之遙。還需要確定實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間是否存在顯著性差異。

首先需要確定的是，用什么方法來進(jìn)行檢驗(yàn)？

因?yàn)楦鲗?shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間毫無相關(guān)存在，所以應(yīng)該采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法。可以使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件來統(tǒng)計(jì)P值，也可以直接使用Excel軟件來進(jìn)行t檢驗(yàn)。

• P<0.05代表存在顯著性差異

• P<0.01代表存在極顯著差異

•  

在本例中，配方一實(shí)驗(yàn)組P值<0.01，配方二實(shí)驗(yàn)組P值

• 配方一藥物處理極顯著提高了p35 mRNA水平的表達(dá)。

• 配方二藥物處理顯著提高了p35 mRNA水平的表達(dá)。

   

總結(jié):

需要強(qiáng)調(diào)的是，本文例舉的方法只適用于單因素處理的比較，該因素（本例中為加藥）處理得到的結(jié)果應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的。在本例中，即表示在相同細(xì)胞中加相同濃度的相同配方藥物，p53 mRNA的變化水平應(yīng)當(dāng)是一致的。

探針法qPCR能夠快捷地提供更加客觀、精確的基因定量檢測(cè)結(jié)果，對(duì)高發(fā)癌癥的普查和診斷、相關(guān)藥物的研發(fā)具有重要意義。

但這項(xiàng)技術(shù)也存在假陽性導(dǎo)致過度診斷的問題，可采用探針法qPCR同時(shí)檢測(cè)多個(gè)相關(guān)基因，或與其他一些技術(shù)如細(xì)胞學(xué)檢測(cè)等結(jié)合應(yīng)用，進(jìn)行綜合性指標(biāo)分析。

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• 易檢：靈敏度更高，適合低拷貝基因，易檢出。

• 更快：預(yù)混型一管化設(shè)計(jì)，使用方便；可進(jìn)行多重檢測(cè)，一次檢出多個(gè)基因。

• 更穩(wěn)：重復(fù)性好，產(chǎn)品性能穩(wěn)定。 

• 更準(zhǔn)：采用抗體型修飾熱啟動(dòng)酶，特異性好，結(jié)果更準(zhǔn)確。

• 更低：性價(jià)比高，實(shí)驗(yàn)成本更低。

   

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